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細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)原理及步驟及注意事項(xiàng)
更新時(shí)間:2020-09-18   點(diǎn)擊次數(shù):10337次

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound Healing)是一種操作簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗(yàn)方法。這種方法的原理是,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí),在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域,稱為“劃痕”,劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合,在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程,是研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)中簡(jiǎn)單的方法。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法,實(shí)驗(yàn)成本低,可以用來檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。


實(shí)驗(yàn)材料:細(xì)胞樣品
儀器、耗材:6孔板 marker筆 直尺 *頭 20微升槍頭(滅菌)
試劑、試劑盒:無血清培養(yǎng)基、PBS

實(shí)驗(yàn)步驟:
一.準(zhǔn)備:
所有能滅菌的器械都要滅菌,直尺和marker筆在操作前紫外照射30min(超凈臺(tái)內(nèi))
二.流程:
(1)準(zhǔn)備工作:所有能滅菌的器械都要滅菌,直尺和marker筆在操作前紫外照射30min(超凈臺(tái)內(nèi))

(2)先用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻地劃?rùn)M線,大約每隔0.5~1cm一道,橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。

(3)在空中加入約5X105個(gè)細(xì)胞,具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同,掌握為過夜能鋪滿。

(4)第二天用槍頭比著直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不要傾斜。

(5)用PBS洗細(xì)胞3次,去除劃下的細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基。

(6)放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、6、12、24小時(shí)取樣,拍照。

 

注意的幾個(gè)問題:

1、劃痕前是不倒培養(yǎng)基的,劃痕后再倒掉培養(yǎng)基加PBS清洗后加吳學(xué)謙培養(yǎng)基;
細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí),在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域,稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。因此是整個(gè)培養(yǎng)皿都加培養(yǎng)基的,觀察部位是劃痕而已。
2、通過算每個(gè)視野的劃痕面積,可以通過image J 軟件計(jì)算。
3、劃痕法的意義在于,價(jià)格低廉,操作簡(jiǎn)單。還有很重要的一點(diǎn)在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡(jiǎn)單單純,容易控制。(比如做加藥的,可能會(huì)和血清的組分有反映,而且受血清批次的影響,造成誤差。如果是鋪了ECM物質(zhì)的,組分就更復(fù)雜了。)
.劃痕法測(cè)量適用的細(xì)胞范圍較小,一般只適用于上皮細(xì)胞,纖維樣細(xì)胞。因?yàn)?/span>
a.這些細(xì)胞本身有遷移能力,且較強(qiáng)。
b.細(xì)胞有極性,方便測(cè)量,觀察。
c.細(xì)胞對(duì)無血清有較強(qiáng)的忍受力(至少24小時(shí)),因此很多腫瘤細(xì)胞系是不適合做劃痕的,很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下,12小時(shí)細(xì)胞凋亡就超過50%。這也就是transwell發(fā)展的大要求。而一些上皮樣細(xì)胞系甚至可以忍受高達(dá)72小時(shí)的無血清實(shí)驗(yàn)。足以彌合劃痕。
4、其實(shí)在傷口彌合中,fibroblast的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行。但是其實(shí)癌細(xì)胞的遷移倒不是側(cè)向爬行那么簡(jiǎn)單,我覺得應(yīng)該是綜合效應(yīng),而且要看是什么類型的腫瘤。因?yàn)閷?duì)于遠(yuǎn)端病灶的轉(zhuǎn)移,顯然是通過血液運(yùn)輸?shù)?。這是一個(gè)細(xì)胞去黏附和再黏附的過程。其實(shí)transwell也不能很好的模仿這個(gè)過程。只是transwell+matrigel可以模仿腫瘤細(xì)胞融解基質(zhì),侵入到正常組織的這個(gè)過程。也就是侵襲。所以對(duì)于做cancer的來說,可能transwell會(huì)更好些。但我覺得并不能就簡(jiǎn)單否定scar assay。細(xì)胞的遷移作為細(xì)胞的一個(gè)正常生理活動(dòng),是表征細(xì)胞生理變化的一個(gè)重要指標(biāo)。這點(diǎn)是很主要的意義。

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